药物毒理学中的肝脏损伤标志物

前言肝脏是机体代谢与解毒的核心器官承担着白蛋白、凝血因子合成葡萄糖的合成与储存胆红素及胆固醇的利用与循环激素代谢以及各类药物的生物转化与解毒等多重生理功能。药物诱导肝损伤DILI是过去 30 年间药物上市后撤出市场的主要原因之一。因此在非临床安全性评估中合理选用肝损伤相关生物标志物并对检测结果进行科学解读是毒理从业者必须掌握的核心技能。 本文将对常见的肝损伤相关生物标志物进行简要介绍。总论目前临床常用的肝损伤相关标志物可分为两大类肝细胞损伤标志物包括丙氨酸转氨酶ALT活性、天冬氨酸转氨酶AST活性、山梨醇脱氢酶SDH活性和谷氨酸脱氢酶GLDH肝胆损伤标志物则包含碱性磷酸酶ALP活性、γ- 谷氨酰转移酶GGT活性、总胆红素TBiL、总胆汁酸TBAs以及 5’核苷酸酶。在所有血清学检测参数中ALT、AST、ALP 和 TBiL是应用频率最高的 4 项核心指标。ALTALT 主要分布于肝细胞胞浆内肾脏、心肌、骨骼肌等组织中也有少量分布。它可催化丙氨酸与 α- 酮戊二酸之间的氨基转移反应生成谷氨酸与丙酮酸。当肝细胞受损时胞浆中的 ALT 会释放至细胞外最终进入血液循环。仅 1% 的肝细胞发生破坏就可使血清 ALT 水平升高一倍因此该指标被世界卫生组织推荐为肝功能损伤最敏感的检测指标。不过 ALT 的特异性存在局限骨骼肌损伤同样会导致 ALT 水平上升若肝损伤同时合并维生素 B12 缺乏或受到吡哆醇 - 5’磷酸抑制剂的干扰ALT 活性可能不会出现预期升高。因此在非临床安全性评价中若无对应组织病理学结果支持需满足血清 ALT 值超出正常上限 3 倍且伴随另一项肝损伤生物标志物的显著异常才可判定为存在肝损伤。ASTAST 可催化天冬氨酸与 α- 酮戊二酸之间的可逆氨基转移反应。和 ALT 类似AST 不仅存在于肝脏中骨骼肌等多种组织也有分布。肝细胞受损时AST 会释放至胞外进而引起血清 AST 活性升高在非临床研究的常用实验物种中骨骼肌损伤同样会导致 AST 活性上升。由于 ALT 在血清中的半衰期更长且 AST 更多结合于线粒体结构中因此肝细胞损伤引发二者同步升高时ALT 的升幅通常高于 AST。 此外非临床安全性评价中动物因固定束缚造成的轻度肌肉损伤也可能引发 AST 水平升高。GLDH谷氨酸脱氢酶GLDH是一种定位于线粒体的酶可介导谷氨酸与 α- 酮戊二酸的可逆转化。肝损伤发生时血清 GLDH 活性会随之上升相较于 ALT其升高幅度更显著、持续时间更长。与 ALT 不同的是血清 GLDH 活性既不受骨骼肌损伤的干扰也不会受糖皮质激素诱导而发生变化。但受限于当前检测试剂的可靠性不足GLDH 目前尚未在非临床研究中作为常规检测指标使用。SDHSDH 分布于多种组织中可催化山梨醇与果糖的可逆氧化还原反应过程伴随 NADPH烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的转化。对于啮齿类、犬类及非人灵长类动物而言SDH 是急性肝细胞损伤的高敏感性、高特异性标志物。不过 SDH 的血清半衰期较短犬体内仅约 4 小时和多数临床化学分析物相比稳定性有限样本需在动物解剖后尽快完成检测因此目前在非临床安全性研究中的应用较少。总胆汁酸 TBAs总胆汁酸在肝脏胆固醇代谢、肠道脂肪及脂溶性维生素吸收过程中发挥重要作用。循环中的胆汁酸水平会受进食、禁食状态的影响而其水平异常升高也可作为肝细胞损伤和 / 或肝功能改变的提示标志。ALP碱性磷酸酶ALP属于水解酶类能够移除多种蛋白质、核苷酸分子上的磷酸基团。它是常用实验动物肝胆损伤的核心生物标志物之一当发生胆管阻塞时血清 ALP 水平会显著上升因此在非临床与临床研究中均作为胆汁淤积型肝损伤的指示指标。和 ALT 类似ALP 对肝胆损伤没有绝对特异性骨骼生长、骨骼疾病、糖皮质激素治疗、微粒体酶诱导等情况都可能导致 ALP 活性增加。在非临床研究中解读 ALP 波动需格外谨慎啮齿类动物体内存在一种肠道来源的 ALP 亚型禁食或厌食状态下该亚型水平下降进食后则会短暂升高会对整体检测结果产生干扰。TBiL总胆红素是衰老红细胞中血红蛋白的分解产物由直接胆红素与间接胆红素共同组成。TBiL 升高通常提示胆汁淤积但也可能由其他因素导致比如红细胞破坏过多使胆红素生成增加、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶等代谢酶受抑制或是肝脏整体功能下降。针对高胆红素血症相关的所有研究数据通常需要进行全面综合的评估才能明确 TBiL 升高的具体原因。GGTγ- 谷氨酰转移酶GGT是一种分布于肝小管的酶作为谷胱甘肽循环的组成部分负责将谷氨酰基团转移至其他受体分子除肝脏外也存在于其他组织中。胆汁淤积状态下GGT 会因表达诱导而水平升高可用于辅助验证胆汁淤积相关的 ALP 活性升高。在犬类中GGT 是胆汁淤积的敏感标志且特异性相对更强。其他指标由于 ALT 等现有肝损伤生物标志物存在特异性不足的问题目前行业内正在持续探索特异性更强且能够额外提供损伤区域、受累细胞类型相关信息的新型生物标志物。过去十年间学术界筛选出了一批具备应用潜力的经典与新兴损伤标志物等待进一步验证。第一组待验证的生物标志物包括 GLDH、苹果酸脱氢酶MDH、对氧磷酶 - 1PON1与嘌呤核苷磷酸化酶PNP第二组验证对象为 SDH、精氨酸酶 1ARG-1及谷胱甘肽转移酶GSTa循环 microRNA 标志物 miR-122 则被纳入第三组待验证行列。