西瓜遗传转化实验原理+实验步骤

📅 2026/7/3 6:51:33 👁️ 次浏览

一、实验原理将西瓜的外植体如子叶与农杆菌共培养在共培养过程中农杆菌会附着在西瓜外植体细胞的表面并将 T-DNA 转移到西瓜细胞中。T-DNA 携带的目的基因会随机整合到西瓜细胞的基因组中。最后利用植物细胞的全能性通过组织培养技术将转化后的西瓜细胞培养成完整的转基因植株。二、实验目的通过农杆菌介导等技术将目的基因导入西瓜细胞经组织培养获得目标性状稳定表达的转基因西瓜植株以用于基因功能研究、品种改良或生物制品生产等。三、实验步骤1.农杆菌准备1质粒转化吸取测序正确的质粒 10μL转入农杆菌感受态细胞中。冰上 30min液氮冷冻 1min加入液体 LB 1mL。放入摇床 28℃,120r/min 培养 4h集菌使用涂布器涂在具有 K/R 抗性的培养基上放入 28℃烘箱培养 2 天。将培养后的农杆菌拿出挑选单菌落划线一天后刮取菌落过夜培养 28℃,210r/min而后使用甘油 300μL菌液 700μL混合后放入液氮冷冻存入-80℃冰箱。2农杆菌检测合成相应的检测引物如下表所示配制 PCR 扩增体系完成配制后充分混匀使用 PCR 仪进行扩增 PCR 程序95℃预变性 5min循环体系为 95℃变性 30s、58℃退火 30s、72℃延伸 2k/min、 35 个循环72℃延伸 10min16℃保存1%琼脂糖胶体系1.5g 琼脂粉加入 150mL1×TAE 溶液放入微波炉加热至完全溶解冷却后加入核酸染料制备凝胶冷却后点样完成电泳过程PCR 扩增结果查看阳性对照及样品的电泳条带清晰、大小正确且阴性对照均无条带的情况下表明该样品可进入下一步骤。2.西瓜遗传转化1种子消毒成熟西瓜种子剥壳后经表面消毒75% 乙醇浸泡 30s→2% 次氯酸钠溶液浸泡10-15min→无菌水冲洗 3-5 次。2准备外植体将消毒后的种子倒进新的培养皿中(每皿大约 50 粒种子)用灭菌水清洗 2 次再用一定量的灭菌水进行浸泡用医用胶带将培养皿封口后放入组培室中黑暗吸胀 3-5天 28℃。3侵染及共培养活化培养挑取含重组载体的农杆菌单菌落接种于含对应抗生素的 LB 液体培养基28℃、200rpm 振荡培养至 OD₆₀₀0.5-0.8对数生长期离心收集菌体用 MS液体培养基重悬至 OD₆₀₀0.2-0.4加入 100μmol/L 乙酰丁香酮AS提升 T-DNA 转移效率。侵染处理将制备好的西瓜外植体浸入农杆菌菌液中室温静置 10-15min期间轻轻摇晃 2-3 次确保外植体表面充分接触菌液取出外植体用无菌滤纸吸干表面多余菌液。共培养将侵染后的外植体接种于含 AS 的 MS 共培养基 24℃、黑暗条件下培养 2-3d避免农杆菌过度增殖。脱菌培养共培养后将外植体转移至含筛选抗生素卡那霉素 50mg/L 或潮霉素 5mg/L与脱菌抗生素头孢霉素 200mg/L 或羧苄青霉素 300mg/L的 MS 培养基28℃、16h 光照培养每 7-10d 更换一次培养基连续培养 3-4 代淘汰未转化细胞与残留农杆菌。4筛选芽诱导脱菌后的外植体在筛选培养基上继续培养约 2-3 周后形成绿色抗性芽原基。5分化芽分化将抗性芽原基转移至芽分化培养基培养 3-4 周诱导不定芽分化。6生根生根培养当不定芽长至 2-3cm 时切下芽苗接种于生根培养基培养 1-2 周诱导形成健壮根系获得完整再生植株。注在此期间对小苗进行基因组 DNA 的提取和 PCR 鉴定以及提取 RNA 和荧光定量分析。3.转基因植株验证1PCR 检测提取转基因植株基因组 DNA用载体特异性引物扩增抗性基因引物示例Kan-F:5′-GTCGCTGTAGGTATCGCTATTG-3′,kan-R: 5′-GTTTACGCGTTGCTTCCGCCA-3′电泳验证目标条带。选择获得抗性基因的阳性株系检测敲除在 CRISPR 编辑位点前后设计引物进行测序检验敲除情况。2qPCR 检测表达量针对待测基因设置 3 对引物进行 qPCR 检测以确定合适的扩增引物。设计三对引物检测目标基因表达量变化对比野生型。3Sanger测序提取基因组后送 Sanger 测序。

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