腺相关病毒伯远生物腺相关病毒

腺相关病毒伯远生物腺相关病毒武汉伯远生物 国家级专精特新小巨人企业国家级重点实验室 科研技术人员500硕博占比40%以上 15年技术沉淀每年完成功能基因研究数量50000长期服务课题组10000含协和、同济、华西、湘雅、中山、军事医学院等顶尖医学研究机构 功能基因研究综合性平台 各类仪器设备投资超1个亿 牵头多项省部级重大专项伯远生物 AAV 平台以高滴度、高纯度和完善质控为核心优势滴度可达 ≥1×10¹³ vg/mL纯度 ≥95%并拥有预制 AAV 现货库能够满足高校科研和基础功能研究的多样化需求。公司建立了全流程质控体系交付周期短、现货资源丰富、流程稳定可靠尤其适合需要快速启动实验的课题组。针对预算有限或需要快速验证的场景伯远生物采用无辅助病毒系统覆盖多种血清型并提供纯化和非纯化两种产品选择适合灵活需求和快速交付。对于小规模验证或前期摸底实验这类配置更具性价比。背景说明在AAV研究的前15-20年中AAV的几个重要方面被表征包括其基因组构型和组成、DNA复制和转录、感染潜伏期和病毒粒子组装。现如今重组AAVrAAV已成为体内基因治疗递送的主要平台。第一种rAAV基因治疗产品是uniQure公司的alipogene tiparvovec(Glybera)于2012年被欧洲药品管理局EMA批准用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症2018年FDA批准了voretigene neparvovec-rzyl(Luxturna)这是第一个获得美国许可的rAAV基因疗法。图 50年AAV时间线Wang D, et al.2019。原理简介AAV属微小病毒科parvovirus为无包膜的单链线状DNA病毒目前的共识认为AAV不会引起任何人类疾病。AAV由直径约26nm的二十面体蛋白质衣壳和约4.7kb的单链DNA基因组组成。衣壳包含VP1、VP2和VP3三类亚基共60种拷贝比例为1:1:10VP1:VP2:VP3。基因组的两端是两个T形反向末端重复序列ITR其末端主要用作病毒复制起点和包装信号其中Rep基因编码4个重叠的多功能蛋白并以其分子量命名为Rep78、Rep68、Rep52和Rep40其中Rep78与Rep68参与AAV的复制与整合Rep52和Rep40具有解螺旋酶和ATP酶活性与Rep78、Rep68共同参与单链基因组的复制Cap基因编码VP1、VP2、VP3在AAV病毒整合、复制和装配中其重要作用编码组装活化蛋白AAP的第三个基因在不同开放阅读框ORF中的cap编码序列内编码并且可促进病毒粒子组装。图 AAV基因组结构Hudry et al. 2019。AAV基因组可以整合到人类细胞中称为AAVS1的基因组基因座中以建立潜伏期。由于AAV具有宿主范围广、安全性高、免疫原性低、表达稳定和物理性质稳定等优点已被广泛应用于基础研究和临床试验中并且AAV载体已成为世界上最常用的基因治疗载体之一。图 rAAV转导通路Wang D, et al.2019。目前AAV有多种血清型不同的血清型对组织或器官有着不同的亲和性因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。其中AAV2、AAV3、AAV9源自人类本身是迄今研究最为彻底、应用最为广泛的AAV载体。表 不同血清型AAV对各组织器官细胞的亲和性各病毒载体生物学特性比较表 不同病毒的生物学特性比较我司载体简介我司AAV血清型种类齐全可提供AAV1-AAV9以及DJ、DJ/8、Rh10等12种血清型而且还可包装双链AAVscAAV。我司AAV载体有CMV、mCMV、CAG、PGK、RK1、EF1a、GFAP等多种启动子可供选择而且还有EGFP、ZsGreen、tdTomato、mCherry、EYFP等多种荧光标记蛋白可供选择同时可以提供诱导型AAV病毒的包装如Tet-On系统等。我司原始细胞腺相关病毒包装载体列表可根据不同的需求选择不同的载体插入不同的位置图 原始商品化腺相关病毒载体服务流程客户在线下单——订单/实验材料确认——目的基因获取——AAV载体质粒构建及测序——载体质粒、辅助质粒、包装质粒共转染293T细胞——AAV病毒收集——病毒浓缩和纯化——AAV质检包括病毒滴度、质粒残留、宿主DNA残留、BSA残留、支原体检测、衣原体检测、内毒素检测、细菌及真菌检测等——可选后续感染目的细胞及相关实验我司默认采用三质粒系统进行包毒若为过表达腺相关病毒包装则需目的基因在3000bp以内如有个性化要求请致电详联服务内容及说明适用范围可用于多种疾病的基因治疗研究包括体内、体外实验同时作为一种有特点的基因转移载体广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。客户下单及项目信息填写在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录请客户按照页面提示填写基因名称注明过表达或干扰、基因ID、序列等信息细胞可选自行提供或我司提供。实验信息实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户并发送实验报告查看网址。实验结题后实验报告、检测结果可在线查看或打印并永久保留。实验周期致电详询实验交付内容1、所有实验的原始数据包括实验过程、实验试剂与设备等2、重组载体的全序列信息和注释信息3、重组载体的酶切图谱4、重组载体测序结果5、引物序列6、病毒质控鉴定报告与结果分析包含滴度鉴定、BCA检测、支原体检测等可选7、1mL高滴度AAV载体不低于1011GC/mL8、0.1mL阴性对照病毒不低于1011GC/mL。AAV的优点1、安全性高。迄今从未发现野生型AAV对人体致病重组AAV基因组序列上去除了大部分的野生型AAV基因组元件进一步保证了安全性2、免疫原性低。当AAV用局部大剂量感染肌肉、脑、眼等组织时很少有感染上的细胞之后被免疫系统所清除对动物实验极有帮助3、宿主范围广。几乎所有处于分裂期和静止期的细胞都可用AAV感染4、表达稳定、持续时间长。可在宿主细胞中形成附加体episome存在于细胞核中在细胞分裂不旺盛的组织中可持续表达5个月以上5、扩散性强。rAAV具有远高于AdV和LVs的扩散性可以穿透血脑屏障是最理想的神经元和胶质细胞感染工具6、物理性质稳定。可使用冰袋运输在60℃不被灭活能抗氯仿7、特异性强。rAAV有十数种常用的血清型不同的血清型对不同的脏器有较高的识别及感染能力。文献示例案例一AAV2感染肝脏图 小鼠肝脏中AAV2介导的转基因表达Wang L, et al. 2010。案例二AAV感染心脏图 五种AAV血清型对心肌细胞特异性基因递送的效率比较Prasad KM,et al. 2011。我司AAV2感染细胞效率参考文献Hudry E, Vandenberghe LH. Therapeutic AAV Gene Transfer to the Nervous System: A Clinical Reality.Neuron. 2019;101(5):839-862.Prasad KM, Xu Y, Yang Z, Acton ST, French BA. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution.Gene Ther.2011;18(1):43-52.Wang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.Nat Rev Drug Discov. 2019;18(5):358-378.Wang L, Wang H, Bell P, et al. Systematic evaluation of AAV vectors for liver directed gene transfer in murine models.Mol Ther.2010;18(1):118-125.我司默认采用三质粒系统进行包毒若为过表达腺相关病毒包装则需目的基因在3000bp以内如有个性化要求请致电详联腺相关病毒Adeno-Associated VirusAAV是一种小型、无包膜、单链 DNA 病毒属于细小病毒科是目前基因治疗和基因功能研究中最常用的病毒载体之一。非致病性 野生型 AAV 从未被发现对人体致病安全性极高低免疫原性 感染后免疫反应小不易被免疫系统清除适合体内实验宿主范围广 可感染分裂和非分裂细胞适用于多种哺乳动物组织表达稳定 载体基因组以附加体形式存在表达持久适合长期研究血清型多样 已发现 12 种以上血清型AAV1–AAV12不同血清型针对不同组织如 AAV8/9 偏向肝脏和肌肉AAV2 偏向神经系统载量有限 基因组约 4.7 kb插入片段容量较小一般4.7 kb包装流程AAV 为缺陷型病毒无法独立复制需要辅助系统才能包装载体构建将目的基因克隆至 AAV 载体质粒载体包含 ITR反向末端重复序列和目的基因但不含 Rep/Cap 基因三质粒共转染将 AAV 载体质粒 辅助质粒含腺病毒基因 E2a、E4、VA 包装质粒含 Rep 和 Cap共转染 HEK293 细胞病毒收集与纯化通常 48–72 小时后收集细胞和上清经纯化获得高滴度病毒滴度检测通过 qPCR 等检测病毒滴度GC/ml确认合格后用于实验