单细胞分析入门（3）—— 细胞注释：给每个细胞群贴上“身份标签”

乔粒基于上篇内容我们进行了pbmc数据的读入、质控、降维教程单细胞分析入门(1)pbmc数据读入、Seurat象创建与基础质控单细胞分析入门(2)-PCA降维聚类:锁定细胞类群的关键两步本篇我们来进行细胞注释及绘图。三、细胞注释9.寻找差异表达特征簇生物标志物寻找每个细胞群Cluster的差异表达基因Marker Genes。通过找出这些Marker基因推断出每个细胞群究竟是哪种免疫细胞比如T细胞、B细胞或单核细胞。①将第2号细胞群单独拎出来与数据集里的所有其他细胞群背景进行基因表达对比。找出2群相对于全部的群哪些基因显著高表达或低表达。②将5号群单独拎出来与第0群和第3群进行对比。当我们发现第5群与第0、3群在UMAP图上离得很近、容易混淆时用这种精准对比能找出它们之间微小的差异基因从而区分开这两个相似的亚型。③自动循环遍历所有的细胞群分别找出每个群相对于其余群的高表达基因正向标记。avg_log2FC代表对数2的倍数变化数值大于1意味着该基因在这个群里的平均表达量是其他群的2倍以上过滤掉那些差异微弱的基因只留下高可信度的强特异性标记物。④单独针对第0号群设置 logfc.threshold 0.25放宽了基因表达的差异起步门槛。 test.use “roc”。放弃了默认的Wilcoxon秩和检验改用ROC曲线分析输出的核心指标不再是“倍数变化”而是“分类能力”或“预测能力”。数值范围在0-1之间越接近1用该基因的表达量来区分“第0群”和“非第0群”的准确率越高。当只想知道“哪个基因最能代表这个群的独特性”时用ROC检验。# 9. 寻找差异表达特征簇生物标志物# 单独拎出簇2的所有标记与数据集里的所有其他细胞群背景进行基因表达对比cluster2.markers-FindMarkers(pbmc,ident.12)head(cluster2.markers,n5)#找到区分第5个集群与第0和第3个集群的所有标记比对cluster5.markers-FindMarkers(pbmc,ident.15,ident.2c(0,3))head(cluster5.markers,n5)# 找到每个聚类相对于所有剩余细胞的标记仅报告正向结果# 1个pbmc.markers-FindAllMarkers(pbmc,only.posTRUE)pbmc.markers%%group_by(cluster)%%dplyr::filter(avg_log2FC1)# 范围为0 - 随机1 - 完美cluster0.markers-FindMarkers(pbmc,ident.10,logfc.threshold0.25,test.useroc,only.posTRUE)可视化#可视化 我们包含多种用于可视化标记表达的工具。 显示表达式概率分布 跨群集、# 以及可视化特征 tSNE或PCA图上的表达是我们最常用的可视化方法。# VlnPlot()FeaturePlot()RidgePlot()CellScatter()DotPlot()VlnPlot(pbmc,featuresc(MS4A1,CD79A))# 绘制原始数据计数VlnPlot(pbmc,featuresc(NKG7,PF4),slotcounts,logTRUE)FeaturePlot(pbmc,featuresc(MS4A1,GNLY,CD3E,CD14,FCER1A,FCGR3A,LYZ,PPBP,CD8A))# DoHeatmap()生成给定细胞的表达热图 以及功能。在这里我们绘制的是前10个标记或全部 每个簇的标记值均为小于10。pbmc.markers%%group_by(cluster)%%dplyr::filter(avg_log2FC1)%%slice_head(n10)%%ungroup()-top10 DoHeatmap(pbmc,featurestop10$gene)NoLegend()①小提琴图针对所有细胞群画出这两个基因的表达量密度分布。这两个基因是B细胞的特异性标志物。如果显示在某个特定的群比如第3群里这两个基因的表达两特别高而在其他群里几乎为零那就说明这个群大概率就是B细胞聚类成功。②小提琴图直接画原始的UMI计数原始转录本数量Y轴取对数。目的看清在极端高表达的情况下原始数据的真实分布情况不受标准化算法的平滑影响。NKG7代表NK细胞或杀伤性T细胞PF4则是血小板的标志物。③表达量的空间定位特征图 FeaturePlot把基因表达量直接投射到之前跑出来的UMAP二维平面图上。每个点代表一个细胞点的颜色深浅代表该基因的表达高低。这些基因的高亮区域在UMAP图上互不重叠各自占据特定的区域。这就能从空间分布上说明聚类算法确实把不同谱系的细胞在物理层面分开了。MS4A1 和 CD79A 是 B 细胞。CD3E 和 CD8A 是 T 细胞特别是CD8阳性T细胞。GNLY 是 NK 细胞或杀伤性T细胞。CD14 和 FCGR3A 是单核细胞其中CD14是经典单核FCGR3A是非经典单核或CD16阳性单核。FCER1A 通常是浆细胞样树突状细胞。LYZ 在髓系细胞单核/巨噬中高表达。PPBP 是血小板的强烈标志物。④把每个细胞群最特异的前10个高表达基因pbmc.markers全部画在一张热图上。10.注释每簇关于每个聚类簇细胞的注释我们可以参考已经发表的文献也可以参考一些专门用于细胞注释的网站https://mp.weixin.qq.com/s/6JgBFoQygCfzUEdIOBngeg其中CellMarker3.0专注于人类、小鼠两大模式生物是目前最全面的细胞标记基因权威资源库之一。PanglaoDBSingle Cell Portal、Single Cell Expression Atlas - EMBL-EBI、scRNASeqDB、Human cell atlas、HCA、DISCO、CancerSEA都是不错的细胞注释的网站可以参考。不过幸运的是本次我们使用的数据有已知的细胞类型相匹配我们就直接定义了。# 10.匹配簇名称new.cluster.ids-c(Naive CD4 T,CD14 Mono,Memory CD4 T,B,CD8 T,FCGR3A Mono,NK,DC,Platelet)names(new.cluster.ids)-levels(pbmc)pbmc-RenameIdents(pbmc,new.cluster.ids)DimPlot(pbmc,reductionumap,labelTRUE,pt.size0.5)NoLegend()library(ggplot2)plot-DimPlot(pbmc,reductionumap,labelTRUE,label.size4.5)xlab(UMAP 1)ylab(UMAP 2)theme(axis.titleelement_text(size18),legend.textelement_text(size18))guides(colourguide_legend(override.aeslist(size10)))plot ggsave(filename./pbmc3k_umap.jpg,height7,width12,plotplot,quality50)#保存注释图片saveRDS(pbmc,file./pbmc3k_final.rds)#保存rds文件留待后用在图中直观得显示每簇的名称。参考https://satijalab.org/seurat/articles/pbmc3k_tutorial.html#set-up-the-seurat-object好了到这里使用pbmc数据进行单细胞分析的流程到此基本结束啦我们下期见乔粒科研工坊以解牛之法析生信观微雀之形览科研。欢迎评论区交流