上周三晚上，实验室的灯还亮着。

我盯着屏幕发呆。

手里那杯美式早就凉透了，上面漂着一层油脂，看着就反胃。

做生信分析的这段时间，感觉头发掉了一把又一哈。

真的，那种绝望感，只有干这行才懂。

老板今天又催了。

说是要快点出结果。

那个临床样本的数据有点乱，批次效应明显得很。

我就想问一句，谁他妈能一次就把数据清洗得干干净净？

不可能吧。

咱们来说点实在的。

很多人以为拿到GEO的数据，扔进软件里跑一跑，差异基因就出来了。

天真。

太天真了。

我刚开始入门的时候，也这么想。

结果出来的火山图，乱七八糟。

P值修正也没做对，导出的表格全是错的。

那时候我才明白，工具只是工具。

脑子才是关键。

先说说数据预处理吧。

这一步最磨人。

你要去看GPL平台，看探针映射。

有时候一个探针对应多个基因，有时候多个探针只对应一个基因。

这时候你就得选。

选哪个？

大部分人的习惯是取均值，或者取最大值。

但我觉得，这得看你的实验背景。

如果你做的是肿瘤相关的研究，某些基因的高表达可能更有意义。

这时候不能随便删。

我在处理这批数据时，就遇到过这种情况。

有个基因在健康组里表达很低，但在对照组里很高。

正常人可能直接过滤掉了。

但我盯着那个探针看了半天。

发现它跟某个特定的通路有关。

我就没忍心删。

结果后面验证的时候，嘿，还真有点意思。

这就提醒我们，别太依赖自动化脚本。

哪怕是用R语言或者Python跑代码。

每一步都要留日志。

都要看一眼中间结果。

不然错了都不知道怎么错。

接下来就是差异分析的核心了。

很多人直接用DESeq2或者limma。

这也是个好东西。

但你得注意分布。

RNA-seq的数据通常是负二项分布。

如果是芯片数据，那是正态分布。

搞混了，结果就不准。

我在做geo测序筛选差异基因这一步时，发现有些样本的离群值特别多。

这时候要用PCA看看。

如果几个样本聚在一起，明显跟其他的分开。

你得考虑要不要剔除。

但不能盲目剔除。

得结合临床信息。

如果那几个离群的样本，正好是某种特殊并发症的患者。

那你剔除它们，可能就丢了最重要的发现。

这就像破案一样。

线索就在异常里。

当然，筛选阈值也是个坑。

log2FoldChange大于1，P值小于0.05。

这是老标准。

但现在大家越来越谨慎。

有时候p Adjust value（校正后的P值）要比P值看重要得多。

不然假阳性太多。

我上次就犯过这个错。

筛出来两百多个基因，拿去查数据库。

发现一大半都是 nonsense。

查不到任何文献支持。

那时候真想把自己电脑砸了。

真心累。

所以啊，别贪多。

宁缺毋滥。

筛选出来的基因，哪怕只有几十个，也要一个一个去查。

GO富集分析，KEGG通路分析。

这些都是基础。

但别光看图表好看。

要结合实际生物学意义。

如果一个基因，在你这个组织里完全没听说过是干嘛的。

但它显著差异。

你得怀疑是噪音，还是新大陆。

我推荐大家多看原始数据。

别光看结果表格。

去IGV里看看reads覆盖情况。

有时候测序深度不够，也会导致假象。

这点很多人忽略。

还有，批次效应。

真的害人不浅。

如果你的样本来自不同医院，不同时间，不同操作人员。

那批次效应可能比生物学差异还大。

这时候必须用ComBat或者其他方法校正。

但我一般不盲目用。

我会先画箱线图看看。

如果校正后，生物学组间的差异反而不明显了。

那可能校正过头了。

这就很尴尬。

所以说，做生信，真的是在走钢丝。

既要技术过硬，又要生物功底扎实。

还得有点运气。

我现在终于有点明白了。

那些大牛发的文章，看似简单，背后全是坑填平的。

咱们这些小透明，还得慢慢爬。

别指望一蹴而就。

每天进步一点点。

把代码跑通，把图画好，把故事讲圆。

这就够了。

下次再有人问我，怎么快速筛选差异基因。

我就告诉他。

没捷径。

除非你不用干活。

开玩笑的。

大家互相打气吧。

这行虽然苦，但看到数据真正揭示规律的时候，那种快乐，无可替代。

哪怕今晚又要通宵。

也得撑住。

为了那点可怜的发际线，拼了。