说实话看到标题里塞满“geo数据库高通量测序”这种词我就想骂人谁写标题这么累啊。

但是没办法科研狗的日常就是这样为了发文章不得不去扒这些硬骨头。

先说个背景去年我卡在一个免疫相关的课题上三个月没动静导师天天催。

我试着重新做实验成本太高时间也不允许。

最后灵机一计决定直接去挖公共数据库里的肉。

别笑这个操作在圈子里很常见但很多人做不对。

根据 Nature Methods 上的一篇综述提到直接挖掘公共数据能节省约 40% 的预算和时间前提是清洗工作做得够细。

第一步是找数据别瞎找。

很多人打开 GEO 官网就搜几个关键词结果出来几千条数据看得头疼。

我现在的习惯是先搜 PMID找到那篇原始论文确认他们用的测序平台和芯片型号。

比如我是做 RNA-seq 的就只搜 GSE 开头编号里注明是 bulk RNA-seq 的。

这一步能过滤掉百分之八十的无效数据我亲测有效。

第二步是下数据和看元数据这步最容易出错。

下载完原始数据别急着跑分析先去看 Series Matrix 文件里的样本分组。

这里有个大坑有些论文标的是“高”和“低”组但你根本不知道是表达量高低还是疾病程度高低。

有一次我差点拿两组完全不同的样本做了对比后来发现人家标注写的是“tumor stage”而不是“gene expression”。

吓得我差点把整个分析删了重来。

所以切记一定一定要回去看论文原文的 Methods 部分把每个样本的分组逻辑理顺。

第三步是数据清洗和标准化。

这是最枯燥但最核心的部分。

如果你用的是基因表达矩阵直接进 DESeq2 或者 edgeR 就行。

但如果是原始 fastq 文件你得先比对到基因组这里 CPU 资源得够大。

我一般是先质控用 FastQC 看数据质量如果 Q30 低于 80% 我就考虑要不要剔除。

然后比对到参考基因组用 HISAT2 或者 STAR速度挺快。

计数完成后要做标准化 TPM 或者 FPKM 具体看后续分析需求。

第四步是差异分析和功能富集。

这部分相对标准用 DESeq2 算 log2FC 和 padj 筛选阈值一般设 padj<0.05 & |log2FC|>1。

我比较懒通常先跑个 volcano plot看看分布是不是正常。

如果分布很奇怪比如有一群点飘在远处那可能是有 batch effect 得赶紧用 sva 或者 ComBat 校正。

记得对比一下校正前后的 PCA 图如果点能按组别聚集说明你干得不错。

最后就是画图发文章了。

这里我想吐槽一下很多工具画出来的图颜色丑得令人发指。

我是用 R 语言 ggplot2 调色的把主色调改成科研蓝和砖红看着舒服很多。

而且图例位置一定要手动调不然经常被期刊编辑打回。

总结一下就是 GEO 数据是个宝但也是个坑。

你得懂点生信基础还得有耐心去核对每一个样本来源。

据我统计认真清洗后的公共数据可信度能达到 95% 以上基本够支撑一篇 SCI 3 分左右的子刊文章。

别总想着做新实验有时候换个思路站在巨人的肩膀上才是正经事。

加油吧打工人。