蛋白免疫印记Western blotWB是分子生物学和生物化学领域检测特定蛋白质的“金标准”但很多人明明步骤都对却要么没条带、要么背景糊或条带畸形熬了无数个夜也难得出一张满意的结果。今天我们整理了史上最详细的Western blot实验流程让你告别无效重复轻松跑出清晰条带Western blot本质是通过凝胶电泳分离蛋白经抗体特异性识别后进行信号可视化的组合技术主要依托蛋白质的分子量差异以及抗原-抗体的特异性结合。1、SDS-PAGE电泳首先将细胞或组织裂解并提取总蛋白随后用SDS处理打开蛋白的高级结构并使其带上负电荷使用还原剂如巯基乙醇、DTT处理打断蛋白质内部的二硫键让蛋白变成线性结构。然后将处理好的样本加样到聚丙烯酰胺凝胶在电场作用下带负电的蛋白从阴极向阳极移动分子量小的跑得快、分子量大的跑得慢最终按分子量大小分离成一条条清晰的条带。2、转膜由于凝胶脆软易碎不便于后续抗体结合因此需要将凝胶上分离好的蛋白条带通过电场力湿转或压力半干转原位转移到坚固的固相支持物上PVDF膜或NC膜。3、抗体识别和信号可视化使用特异性抗体精准靶向目标蛋白再通过二抗抗一抗的抗体与一抗结合形成“目标蛋白-一抗-二抗”复合物。最后加入化学发光底物如ECL后经由酶催化底物反应目标蛋白所在位置就会出现黑色条带其中条带的深浅和粗细在一定范围内能反映目标蛋白的相对含量。一、样品制备1、样本采集与保存细胞样本需去除培养基用PBS清洗2-3次避免培养基成分干扰组织样本取材后立即用液氮速冻-80℃密封保存防止蛋白降解血液、体液样本需提前去除高丰度蛋白减少干扰。2、蛋白裂解根据目标蛋白类型选择合适的裂解液含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂冰上孵育30 min期间反复颠倒混匀确保细胞/组织充分破碎。⚠️常规可溶性蛋白使用RIPA裂解液核蛋白用NP-40温和裂解液难溶性蛋白、膜蛋白用含SDS的强裂解液。3、蛋白提取4℃、12000 rpm离心15 min收集含总蛋白的上清液离心时全程低温避免蛋白变性。4、蛋白定量使用BCA法或Bradford法测定上清液中蛋白浓度便于确保后续上样量一致避免因上样量差异导致条带深浅失真。⚠️BCA法灵敏度高受去垢剂影响小Braford法操作简单通常每孔上样20-50 μg细胞样本可适当减少至10-30 μg。5、蛋白煮样按比例加入5×上样缓冲液含SDS和还原剂95-100℃煮沸5-10 min使蛋白完全变性为线性结构煮沸后立即冰浴5 min然后4℃、5000 rpm离心5 min去除沉淀避免上样时堵塞泳道。⚠️检测膜蛋白时不能煮样否则会形成二聚体或多聚体一般选择37℃放置10min进行蛋白变性处理。二、SDS-PAGE凝胶制备SDS-PAGE凝胶分为浓缩胶和分离胶双层胶系统能提高蛋白分离效率上层浓缩胶主要将蛋白压缩成窄带提高分辨率下层分离胶主要用于分离不同分子量大小蛋白。1、凝胶浓度选择根据目标蛋白分子量调整分离胶浓度浓缩胶固定为5%分离胶浓度参考如下2、凝胶配制根据凝胶配方依次加入分离胶缓冲液、丙烯酰胺、去离子水、10%过硫酸铵AP、TEMED最后加入快速混匀后倒入模具中配制分离胶上层覆盖一层去离子水或异丙醇室温静置30-6 min待凝胶完全聚合后倒去上层液体用滤纸吸干残留水分再配制浓缩胶加入模具后插入齿梳室温静置20-30 min待浓缩胶聚合完全后轻轻拔出齿梳。⚠️过硫酸铵AP和TEMED需新鲜配制TEMED是催化剂加入后凝胶会快速聚合需快速操作凝胶配制或者齿梳插入时避免产生气泡否则会导致泳道变形。三、上样与电泳1、凝胶安装将配制好的凝胶固定到卡槽并放入电泳槽中加入电泳缓冲液缓冲液需没过凝胶上表面避免干涸。2、样品上样用微量移液器吸取变性后的样品缓慢加入泳道中每孔上样量根据蛋白浓度调整并注意避免样品溢出。⚠️预留预染蛋白Marker泳道用于后续判断蛋白分子量和电泳进度两侧空白泳道可加入空白缓冲液减少边缘效应。3、电泳参数设置采用恒压模式在浓缩胶阶段设置80V电泳20-30 min直到样品全部进入分离胶然后调整电压至120V继续电泳直到溴酚蓝指示剂上样缓冲液中的染料迁移至凝胶底部终止电泳。⚠️电泳过程中可在电泳槽外放置冰袋避免电泳过热导致条带弯曲、拖尾四、凝胶转膜转膜的核心是将凝胶上的蛋白条带完整、均匀地转移到固相膜上常用湿转法和半干转法。⚠️湿转法效率高适合所有分子量蛋白半干转法速度快适合中低分子量蛋白。1、膜的选择与处理膜的大小需完全覆盖凝胶的分离区域避免蛋白条带遗漏。PVDF膜结合能力强、机械强度高可重复使用适合低丰度蛋白使用前需用甲醇浸泡1-2分钟激活膜上的疏水基团增强蛋白结合能力。NC膜硝酸纤维素膜背景低无需甲醇活化操作简便适合高丰度蛋白但质地较脆易破损。2、转膜“三明治”结构按“阴极→海绵→滤纸→凝胶→膜→滤纸→海绵→阳极”的顺序组装转膜“三明治”结构湿转法。⚠️确保无气泡否则会导致局部蛋白转移失败出现空白条带确保凝胶朝向阴极、膜朝向阳极蛋白会从阴极向阳极转移方向错误会导致转膜失败。3、转膜参数设置湿转法转膜时加入转膜缓冲液恒流模式200 mA进行转膜转膜时间根据蛋白分子量调整并且全程冰浴避免膜过热导致蛋白变性半干转法转膜时一般转膜时间15-60 min并且无需全程冰浴但对高分子量蛋白转移效率较低。⚠️转膜液中含20%甲醇增强蛋白结合力转膜时间根据蛋白分子量调整一般按照1 min/kDa进行设置4、转膜验证转膜结束后可将膜用丽春红染色2-5分钟快速观察总蛋白条带是否均匀转移。⚠️丽春红染色为可逆染色后续可洗去不影响实验。五、封闭处理转膜后的膜上有大量未结合蛋白的空白位点若不封闭后续抗体会非特异性结合这些位点导致背景过高、条带模糊。1、封闭液选择封闭液用TBST缓冲液配制现配现用。5%脱脂奶粉最常用经济实惠适合大多数常规检测但含酪蛋白磷酸化和生物素检测磷酸化蛋白或糖蛋白时禁用。5% BSA牛血清白蛋白适合检测磷酸化蛋白、生物素标记蛋白背景更低但成本较高。2、封闭操作将膜完全浸泡在封闭液中室温摇床孵育1-2 h或4℃摇床孵育过夜进行封闭。⚠️4℃封闭效果更好且能减少非特异性结合。3、封闭后处理封闭结束后用TBST缓冲液洗涤膜3次每次5-10 min洗去多余的封闭液避免影响后续抗体结合。⚠️封闭时间不可过短否则封闭不充分背景高也不可过长否则可能导致蛋白脱落信号减弱检测磷酸化蛋白时必须用BSA作为封闭液避免奶粉干扰。六、抗体孵育抗体孵育是WB特异性的核心一抗和二抗的选择、浓度和孵育条件直接决定条带的清晰度和特异性。1、一抗孵育选择合适的抗体室温摇床孵育1-2 h或者4℃摇床过夜孵育完成后用TBST缓冲液洗涤膜3次每次5-10 min彻底洗去未结合的一抗。抗体选择根据目标蛋白选择特异性高的一抗单克隆抗体特异性强、杂带少多克隆抗体亲和力强、适合低丰度蛋白稀释比例严格按照抗体说明书推荐比例稀释常见1:500-1:2000避免抗体浓度过高导致背景高或过低导致信号弱。孵育条件4℃摇床过夜孵育特异性最佳室温摇床孵育1-2小时效果略差。2、二抗孵育选择与一抗物种来源匹配的二抗室温摇床孵育1-2 h完成后用TBST缓冲液洗涤膜3次每次5-10 min彻底洗去未结合的二抗。⚠️抗体可分装保存避免反复冻融导致失效孵育荧光二抗时需避光孵育避免抗体失效。七、显影与成像显影的核心是将抗体结合的信号转化为可见条带常用化学发光法ECL操作简单、灵敏度高。1、显影液配制将ECL显影液A液和B液按1:1混合现配现用避免提前配制导致信号减弱。2、显影操作将混合好的显影液均匀滴加在膜上确保完全覆盖膜的表面室温孵育1-2分钟让酶与底物充分反应。3、成像检测将膜放入化学发光成像仪中选择合适的曝光时间和曝光强度进行图片曝光并采集图像。4、结果分析根据预染Marker的分子量判断目标条带的分子量是否与预期一致然后用ImageJ、Image Lab等软件以内参蛋白为参考计算不同样本目标条带的相对表达量。